(一) AAV-293細胞的凍存
隨著傳代的次數(shù)增加，AAV-293 細胞會出現(xiàn)生長狀態(tài)下降、突變等。為了防止此類現(xiàn)象的出現(xiàn)，我們需要在開始就對細胞進行大量凍存，以保證實驗的穩(wěn)定性和持續(xù)性。在細胞對數(shù)生長期進行凍存，增加細胞復蘇成活率。
1、去掉細胞培養(yǎng)上清液，加入PBS 洗去殘留的培養(yǎng)基;
2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min 后，鏡下觀察細胞變圓，細胞間間隙加大時，去除胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基吹打混勻，移入離心管中。
3、細胞計數(shù)，將細胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃ 預熱的 10% DMEM，用 10mL 移液管進行吹打，較大力吹打 6-8 次即可，不留死角，之后，將所有細胞吸出，置于15mL 離心管中，取 50ul 混勻后的細胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即為 10 倍稀釋，混勻，取 10ul 細胞于計數(shù)板中計數(shù)。計數(shù)板上共 4 大格，每大格 16 小格。計數(shù)時，4 大格均計數(shù)，總數(shù)除以 4(得每大格細胞數(shù))，再乘以 10(10 倍稀釋)，即為實際 n 萬/mL 細胞濃度。
4、細胞離心，1000 rpm/min，5min。去掉上清。
5、根據(jù)細胞計數(shù)結(jié)果加入細胞凍存液(70%完全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO)重懸細胞，密度為3 x 106 個/ml。
6、分裝進細胞凍存管，放入凍存盒中，放入-80℃超低溫冰箱。
7、第二天將細胞放于液氮罐中長久保存，并作記錄。保存過程中，要不時復蘇細胞檢測細胞存活率，觀察細胞狀態(tài)等。
(二)AAV-293 細胞的傳代
當細胞生長到匯合率達到 80%~90%時需要對細胞進行傳代操作，以擴大細胞數(shù)量，維持細胞良好的生長狀態(tài)。
1、消化細胞，方法同細胞凍存。
2、細胞離心結(jié)束后，加入完全培養(yǎng)基重懸。
3、根據(jù)具體情況，將細胞分到10cm 培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿補足到10ml 培養(yǎng)基。
(三)AAV-293 細胞的復蘇
當細胞傳代次數(shù)過多，細胞狀態(tài)變差時，或者細胞出現(xiàn)污染事故時，需要丟棄并對最初凍存的細胞進行復蘇。
1、設置溫度為37~42℃的水浴。
2、查看細胞庫記錄，根據(jù)記錄從液氮罐中取出凍存的細胞(需戴上棉手套，防止被凍傷)，迅速丟入水浴鍋中并快速晃動，盡量在1~2min 內(nèi)使細胞溶液完全
溶解。
3、將細胞溶液轉(zhuǎn)移到15ml 離心管中，并在其中加上1ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻后離心，1000 rpm/min，5min。
4、去掉上清，加入5ml 新鮮的完全培養(yǎng)基，混勻沉淀后，轉(zhuǎn)入6 cm 培養(yǎng)皿。
5、將培養(yǎng)皿平穩(wěn)放入37℃、5% CO2 和95%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
6、第二天觀察細胞存活率。給細胞換一下培養(yǎng)基。以后每天觀察細胞生長情況。



 

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